智能化葡萄糖钳夹技术评价-中国糖尿病杂志2009年10月第17卷第10期

陈重 余桂芳 钟锦均 韩锋 傅晓莹 邝建 杨华章
【摘要】目的 评价智能化高胰岛素�正常葡萄糖钳夹技术的临床实用性和重复性。方法 应用智能化葡萄糖钳夹技术对20例实验对象（正常糖耐量16例，糖耐量异常（IGT）4例，其中合并多囊卵巢综合征(PCOS)各2例）行正糖钳夹试验,其中3例正常糖耐量者在1月内重复实验。结果 (1)23例次钳夹实验进入稳态期时间平均为105.57�26.72分钟；(2)稳态期平均血糖离散值为0.10�0.06mmol/L；血清胰岛素平均水平94.64�13.72pmol/L；(3)3例正常个体重复试验稳态葡萄糖利用率（Gu）差值平均为-0.19�0.91mg/(kg．min)（t=0.385,p=0.754）；(4)正糖钳夹测定的Gu与HOMA1-IR的线性相关系数R=0.614(P=0.011),与HOMA2-IR线性相关系数R=0.593 (P=0.02)。结论：智能化葡萄糖钳夹操作相对简捷，较快进入稳态，血糖钳夹精确性高，稳定性和重复性好。HOMA-IR指数与钳夹技术测定的Gu有显著的线性关系。
【关键词】智能化；葡萄糖钳夹；胰岛素抵抗；HOMA指数
Intelligent Glucose Clamp Technology Evaluation
CHEN Zhong，YU Gui-Fang，ZHONG Jin-jun，et al. Department of endocrinology，Guangdong Provincial People�s Hospital， Guangzhou 510080， China
Corresponding author: YANG Hua-zhang, E-mail: yanggdph@hotmail.com

【Abstract】Objective To evaluate the intelligent hyperinsulinemic euglycemic clamp technique in clinical practicality and repeatability. Methods Application of intelligent glucose clamp technique in 20 subjects (16 subjects with normal glucose tolerance, 4 subjects with IGT, 2 subjects with polycystic ovary syndrome (PCOS) in two group respectively) is to test euglycemic clamp. In a month, three subjects of normal glucose tolerance repeated experiments. Results (1)The average of steady-state experimental time were 105.57�26.72 minutes. (2)In steady-state, the average discrete value of blood glucose was 0.10�0.06mmol/L, the average of serum insulin levels was 94.64�13.72pmol/L.(3)The average margin of glucose utilization (Gu) in the repeated test of 3 normal individuals was -0.19�0.91mg/(kg.min). (t = 0.385, p = 0.754) (4)Linear correlation coefficient of Gu tested by euglycemic clamp and HOMA1-IR was 0.614(P=0.011), and linear correlation coefficient of Gu and HOMA2-IR was 0.593 (P=0.02). Conclusion Intelligent glucose clamp operation is easily and conveniently, stepping into steady-state rapidly, and it has high accuracy, stability and good reproducibility. There is significant linear relationship between HOMA-IR index and Gu which is tested by clamp technique.
【Key words】Intelligent; Glucose clamp ; Insulin sensitivity; homeostasis model assessment (HOMA)

基金项目：2007广东省科技计划项目 (编号2007B080701021)
作者单位：510080 广东省人民医院内分泌科
通信作者：杨华章，E-mail: yanggdph@hotmail.com

葡萄糖钳夹技术是目前公认的评价机体胰岛素敏感性的金标准[1]，该技术在研究胰岛素抵抗程度和机制，阐明药物对胰岛素的敏感性作用有极其重要的价值。目前的钳夹技术多为手工操作，血糖钳夹水平偏差较大，费时烦琐，需要较多人员同时参与操作，使其应用范围受到明显的限制，仅适于基础研究，而缺乏临床应用价值。为此，我们采用了国外先进的半闭环智能化葡萄糖钳夹技术系统，将胰岛素及葡萄糖的输注完全由电脑根据即时监测的血糖进行计算控制，对20例受试者行高胰岛素－正糖钳夹测试，评价该系统的临床实用性和重复性。

对象与方法

一、对象
20例实验对象为广州地区中国人。按WHO1999年诊断标准，正常糖耐量男10例，女4例，共14例，平均年龄25.9�4.8岁；IGT男1例女3例其中2例合并多囊卵巢综合征(PCOS)；多囊卵巢综合征且糖耐量正常2例；其中3例正常糖耐量者在1月内重复实验。研究对象均排除高血压、肝、肾疾病，排除急、慢性胃肠道疾病。未使用任何影响胰岛素敏感性药物。试验前3天,研究对象每日碳水化合物饮食不少于200g,维持体重稳定。试验前,将试验的性质、目的以及可能产生的不良反应告知研究对象,并填写知情同意书。

二、方法
1.试验前准备：受试对象空腹12小时,次晨8时到实验室, 排空小便并测定身高、体重后仰卧，分别在双前臂头静脉或正中静脉穿刺并留置导管以0.9%NaCl液维持静脉通道,以备抽血及输注各种试验用液。此时取血标本的一侧前臂置于恒温加热毯中(温度55℃)以使静脉血动脉化。整个实验是在研究对象清醒安静状态下进行。
同时启动电脑进入CLAMP应用程序,在实验模式中选取正常血糖钳夹模式，选择参数并输入基本数据。抽取基础血样用BIOSEN葡萄糖分析仪测定并在程序中输入病人基础血糖，患者的体重以及胰岛素最大剂量和初始剂量，注射持续时间，电脑即时计算出实验过程所需胰岛素的总量，在总量的基础上增加3-4u以抵消胰岛素在注射管壁的吸附。将胰岛素加入装有50毫升0.9%NaCl的注射器连接和启动电子胰岛素泵和葡萄糖输液泵开始钳夹实验。
2.高胰岛素-正常葡萄糖钳夹技术：试验0-10min内以2mU/kg/min胰岛素输注率注入初始负荷剂量胰岛素溶液(丹麦Novo诺和诺德公司人正规胰岛素)使血浆胰岛素水平迅速升高保持在100Mu/L，随后以1mU/(kg.min)速率持续输注,获得浓度近于80-100μU/ml(�10%)的血胰岛素水平的平台。试验开始10分钟后，每隔5min测定一次动脉化的静脉血浆葡萄糖，电脑可以即时记录血糖水平、根据血糖值计算葡萄糖输注率和相应的葡萄糖利用率，并相应调整20％葡萄糖液输注率予以输注，维持血糖浓度保持在预设目标浓度（研究对象空腹血糖值），通常在4.4～5.0mmol/L。试验过程中每30min取血测定胰岛素、C肽。所有血样均经离心分离血清或血浆，一20℃保存至测定。
3.实验仪器和检测方法：德国EKF智能化葡萄糖钳夹系统：BIOSEN C_Line血糖/乳酸分析仪1台，装有葡萄糖钳夹实验软件（德国内卡公司提供）的医用个人电脑（WindowsNT/2000,符合EN60601-1标准），TFT医用监视器（符合EN60601-1标准），精密注射泵（费森尤斯InjectomatC-ISO）,容积泵（费森尤斯INCA-ST）。血浆葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法(BIOSEN C_Line血糖乳酸分析仪，德国Neckar公司)；血清胰岛素、C肽采用电化学发光法（德国Roche公司E170电化学发光免疫分析仪）。
4.计算方法:
（1）胰岛素-葡萄糖代谢稳定状态(钳夹稳态期)所需时间：稳态期是指高胰岛素状态下,血糖持续稳定在目标血糖值，葡萄糖输注率变化最小的期间。
（2）稳态期平均血糖离散值均数（稳态期血糖与目标值的差值）。
（3）稳态葡萄糖利用率(Gu)：血糖进入钳夹稳定期后,计算此时的Gu作为IR程度的指标。
（4）计算3例正常个体前后两次试验Gu的差值，了解重复性。
（5）钳夹技术评估胰岛素抵抗指数：HOMA1-IR = FIns �FPG/ 22.5
HOMA2-IR 来自 www.OCDEM.ox.ac.uk

三、统计学处理
采用SPSS13.0软件进行统计处理。计量资料以均数�标准差(ｘ�ｓ)表示。试验数据前后对照采取配对T检验，相关分析用直线相关分析，显著性水准为0.05。

结 果

1．23例次的钳夹实验中,进入稳态期时间最短为75分钟,最长为189分钟,平均为105.57�26.72分钟。(图1)
2．稳态期平均血糖离散值均数为0.10�0.06mmol/L,最大值为0.21mmol/L,最小值为0.04mmol/L。
3．正常人群Gu为7.67�1.39mg／(kg.min),范围为5.54～9.98mg／(kg.min)；HOMA1-IR为1.25�0.79，HOMA2-IR为0.90�0.56；4例IGT的Gu为4.47�1.54mg／(kg.min)，HOMA1-IR 2.27�0.87mg／(kg.min)和HOMA2-IR 1.49�0.45mg／(kg.min)，其中2例合并PCOS的Gu为4.12和3.75mg／(kg.min)；2例糖耐量正常的PCOS患者Gu分别为3.27和3.55mg／(kg．min)，平均3.41�0.20mg／(kg.min), 其中HOMA1-IR、HOMA2-IR分别为15.2,9.71和3.20,2.19。
4．3例正常个体前后两次试验葡萄糖利用率（Gu）差值平均为-0.19�0.91mg/(kg．min)（t=0.385,p=0.754）。
5．稳态期胰岛素浓度均值为94.64�13.72pmol/L。
6．正糖钳夹测定的Gu与HOMA1-IR的线性相关系数R=0.614(P=0.011),与HOMA2-IR线性相关系数R=0.593(P=0.02).
血糖BG（mmol/L）
葡萄糖利用率Gu (mg/kg/min)

讨 论

智能化钳夹系统根据葡萄糖钳夹技术的原理研制开发的半闭环系统，由胰岛素输注泵、电脑及葡萄糖输注泵组成，并与BIOSEN5030全自动葡萄糖分析仪相连，它具备三种钳夹的实验模式：正常血糖钳夹、低血糖钳夹和高血糖钳夹。正常血糖高胰岛素钳夹技术是在胰岛素-葡萄糖代谢平衡状态下精确测定组织对胰岛素的敏感性。本研究选择20例自愿者（其中包括正常糖耐量，IGT，多囊卵巢综合征）运用智能化系统进行了正糖钳夹实验，整个研究过程顺利，稳定性较好，试验中观察到按照该系统要求的开始0-10min内以2mU/kg/min胰岛素输注率输入初始负荷剂量胰岛素，随后以1mU/kg/min速率持续输注,可以较快进入稳态，并获得浓度近于80-100μU/ml(�10%)的血胰岛素水平平台。贾伟平[2]等通过扩展高胰岛素一正葡萄糖钳夹的研究发现：当胰岛素高峰浓度为93.14�12.45mIU／L，维持浓度在63.00�4.86mlU／L时，肝糖的产生完全被抑制。结合国外文献[3]，我们采用的方法可以使稳态时受试者的胰岛素浓度均值为94.64�13.72pmol/L，已足够使肝糖产生完全被抑制，排除内源性葡萄糖的影响。系统的电脑程序可以直接根据葡萄糖的输注率计算葡萄糖利用率来总体评估机体的胰岛素敏感性，还可以将实验数据列表储存并可导出数据采用第三方软件进行处理，使试验数据处理更简便易行。
自De Fronzo[1]1979年创立以来，经过不断地实践，目前葡萄糖钳夹技术已成为胰岛素抵抗、糖尿病病理生理、病因学研究以及糖尿病药物开发与研究的金标准技术。在国外上述相关研究中被广泛使用，而国内开展此技术者甚少，可能与此技术操作复杂有关。目前的钳夹技术多为手工操作，耗时长，复杂烦琐，需要医生，护士，实验员等多人同时参与，易产生人为误差，使钳夹血糖水平偏差较大，局限了其应用范围和价值。智能化葡萄糖钳夹技术系统在试验过程中，胰岛素及葡萄糖的输注量计算及调整可以完全由电脑根据监测的血糖值控制，23例次的钳夹实验,进入稳态期时间最短为75分钟，平均为105.57�26.72分钟；整个过程只需两个工作人员参与，在放置好血管留置针后，甚至可由一个医生完成随后的钳夹过程。相对于手工操作进入稳态需要120-240分钟[4，5]，该系统避免了手工计算与调节输液的延时与误差，显著节省进入稳态和完成钳夹的时间与人员配置。
我们在研究中观察到钳夹进入稳态1小时后，随着时间推移Gu逐渐升高到另一个平台，与Mattias[5]等观察的一致，提示随着时间延长可能增加了非氧化葡萄糖处理。一般进入稳态期需要90-120分钟，维持时间约30分钟，若持续时间超过1小时则Gu逐渐升高到另一个稳态，也有学者观察到同一个个体不同胰岛素稳态浓度也会测得不同的Gu[6]，提示Gu可能要在相似的稳态时间、相似的胰岛素稳态浓度下进行比较。
Mattias等[5]研究发现高胰岛素一正葡萄糖钳夹方法的重复性上，个体变异系数变化范围较大在2-22%之间，这有可能与钳夹实验由人工操作有关，即使主要操作是由同一位经验丰富的研究者承担，人为误差还是再所难免。本研究中，稳态期平均血糖离散值均数（稳态期血糖与目标值的差值）为0.10�0.06mmol/L,最大值为0.21mmol/L,最小值为0.04mmol/L；3例正常个体前后两次试验葡萄糖利用率（Gu）差值平均为-0.19�0.91／(kg．min)；显示良好的精确性、稳定性和重复性，尽量避免了人为操作和计算的误差。
本研究中，正常人群Gu为7.67�1.39mg／(kg.min),范围为5.54～9.98mg／(kg.min)；与国内外的研究相似[2,5]；4例IGT的Gu为4.47�1.54mg／(kg.min)；2例单纯PCOS患者Gu为3.41�0.20mg／(kg.min)。很好地反映了胰岛素抵抗的变化。
另外，试验中HOMA1-IR及HOMA2-IR随Gu的降低而升高，以HOMA1-IR更为明显。HOMA指数是从空腹血糖和胰岛素或C肽浓度来评价胰岛素抵抗和B细胞功能的，由于其简便易行，越来越广泛地用于不同种族人群的临床研究和流行病学调查。本研究通过对�金标准�血糖钳夹试验法测定作为胰岛素抵抗指数的Gu与HOMA1-IR，HOMA2-IR进行线性相关分析，显示Gu与HOMA1-IR的线性相关系数R=0.614(P=0.011),与HOMA2-IR线性相关系数R=0.593 (P=0.02)，有显著的线性关系,与国外研究基本一致[7]。
综上所述，智能化葡萄糖钳夹具有技术操作相对简捷，可较快进入稳态，血糖钳夹精确性高，稳定性和重复性好，节省人力等特点，符合基础研究与临床应用要求,使临床应用葡萄糖钳夹技术精确测定与评价胰岛素抵抗成为可能。

参考文献：
1 DeFronzo RA,Tobin JD ,Andres R. Glucose clamp technique:a method for
quantifying insulin secretion and resistance.Am J Physiol, 1979 ,273:214-223.
2 贾伟平，陈蕾，项坤三，等．扩展高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术的建立.中华内分泌代谢杂志，2001，17：268�271．
3 Rizza RA , Mandrino LJ , Gerich JE. Dose-response characteristics for effects of insulin on production and utilization of glucose in man.Am J Physiol , 1981 ,240 : 630-639.
4 喻红玲，余叶蓉，袁丽，等.正常血糖高胰岛素钳夹技术的应用及护理. 中华护理杂志, 2003,38(10):785-87
5 Mattias S, Jonas N, Kerstin B,et al. The hyperinsulinaemic-euglycaemic glucose clamp: reproducibility and metabolic effects of prolonged insulin infusion in healthy subjects. Clinical Science ，2000，98, 367�374
6 罗四川,李启富,黄健康,等.两步法高胰岛素-正常葡萄糖钳夹技术的建立.中华糖尿病杂志，2005，13：39-42
7 Bonora E, Targher G, Alberiche M, et al. Homeostasis model assessment closely mirrors the glucose clamp technique in the assessment of insulin sensitivity. Diabetes Care , 2000 ,23 :57-63.